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      Ames試驗:利用細菌檢測基因突變的方法

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


      Ames試驗:利用細菌檢測基因突變的方法 

      Ames試驗  即鼠傷寒沙門氏菌營養缺陷型回復突變試驗,是目前檢測基因突變最常用方法之一. 
       
      原理:利用鼠傷寒沙門氏菌突變株,即組氨酸缺陷型,其原始菌株菌體內的組氨酸是通過自身一系列酶催化反應合成的,這種能自身合成所需營養成份的菌株叫做野生型菌株.本試驗用鼠傷寒沙門氏菌為突變株,其不能合成組氨酸,而必須由外界提供這種菌珠被稱為營養缺陷式營養實變型(his-).當誘變劑作用于菌株后,在菌株遺傳物質的特定位點發生基因回復突變成為野生型(his+),故在缺乏組氨酸的培養基上,只存少數自發回變菌落生長,而能誘發細菌回變的致突變物可使細菌生長增多,從而可判斷被藥物是否具有致實變性. 
       
      材料:菌株,鼠傷寒沙門氏菌TA97,TA98,TA100,TA102. 
      器材:恒溫培養箱,干燥箱,高壓消毒鍋,水溶鍋,紫外線燈(15w),藥物天平,分析天平 酒精燈,濾紙片,平皿,試管,燒杯,吸管. 
       
      Vogel-Bonner液10×(VB液10倍濃縮)用于配制底層基本培養基.配制方法:硫酸鎂(毫克SO4?7H2O)1g,檸檬酸(C6H8O7?H2O)10g,磷酸氫二鉀(K2HPO4?3H2O)65.5g,磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4?4H2O)17.5g.將上述成分依次用蒸餾水溶解、混勻,然后加蒸餾水至500毫升,置4攝氏度冰箱保存. 
      底層基本培養基  取VB液(10倍)100毫升,加入蒸餾水800毫升,用1mol/L NaOH調pH至7.0,然后加入瓊脂12—15g,經121攝氏度20分鐘高壓滅菌.待冷至800C左右時,加入100毫升已經112攝氏度20分鐘高壓滅菌的20%葡萄糖液,混勻后澆制平板. 
      上層培養基  D-生物素12.4毫克,L-鹽酸組氨酸9.5毫克,NaCl5g,瓊脂6g,上述成分依次加熱溶解,混合,然后加蒸餾水至1000毫升.分裝后經121攝氏度15分鐘高壓滅菌備用. 
       
      方法 
      藥物的劑量選擇 
      對于易溶解的藥物,實驗最高劑量可采用抑菌濃度下的最大劑量,或以最大溶解度為最高劑量和5毫克/皿為最高劑量,下設5個劑量,(即5000,500,50,5,0.5,0.1μg/皿).溶劑:藥物是水溶性,可用滅菌蒸餾水,如非水溶性可選二甲亞砜為溶劑. 
       
      平板摻入法 
      每皿加底層培養20~25毫升,待凝固.取融化并保溫于45攝氏度的上層培養基,分裝于5毫升試管中,每支試管2毫升,依次加入新鮮菌液0.1毫升, 藥物0.1毫升,需加S9時則加入S9混合液0.3毫升,混勻,迅速倒在底層培養基上,使之分布均勻.待上層瓊脂凝固后,翻轉平板置37攝氏度培養48小時后,觀察結果.
       
      結果評價
      觀察結果時,首先應觀察各實驗組和陰性對照的背景菌苔的生長情況.在肯定背景菌苔與陰性對照相差不多后,再比較各劑量組的回變菌落數.若回變菌落數的出現有劑量反應關系,回變菌落數大于自發對照的2倍或以上,結果并具有重現性,并有統計學意義的增加,可判斷為陽性,反之為陰性.
       
      附錄:Ames 試驗記錄表,實驗者可視需要對表加快修改
      對所用菌株進行鑒定 
       
      組氨酸營養缺陷(his-)鑒定.取兩塊底層葡萄糖瓊脂平板,其中一塊加入0.1mol/L L 一組氨酸0.1mol和0.5mmol/L生物素0.1毫升,另一塊(對照)只加入生物素.用白金耳先在生物素對照平板上劃線,然后再在組氨酸/生物素平板上劃線,四種菌株可劃在同一平板上.在培養皿底部用標記筆注明每一菌株劃痕.翻轉平板,37攝氏度培養24~48小時,觀察細菌生長情況.對照平板無細菌生長,含組氨酸平板應有細菌生長. 
       
      深粗糙突變(rfa)鑒定—結晶紫抑菌試驗  加0.1毫升等測菌液于裝有2毫升上層培養基(融化后保持在45攝氏度)的試管中,旋搖混勻后傾倒于營養瓊脂平板上,傾斜旋轉平板使之分布均勻.凝固后,將一滅菌濾紙片放在平板上,于紙片中心滴加1毫克/毫升結晶紫10μl,或先用滅菌濾紙片沾取結晶紫液,再放置平板上.倒置平板,在37攝氏度培養12~24小時如在紙片周圍出現明顯的抑菌帶(約10mm),則表明有rfa突變存在. 
       
      uvrB鑒定——紫外線敏感試驗  用滅菌拭子拈取測試菌株在營瓊脂平板上做平行劃線.有R因子的菌株(TA97,TA98,TA100等)劃線在另外的平板上.用黑紙遮住無蓋平板的一半,另一半在距離33cm處,用一個15W紫外線燈照射,有R因子菌株照射8秒鐘.在同一平板上,應用時用切除修復功能的菌株(如TA102)作為對照.平板照射后,在37攝氏度培養1~24小時,具有uvrB缺陷的菌株,只在未經照射的一側平板上生長. 
       
      R因子(pKM101質粒)鑒定—抗氨芐青霉素試驗  用10μl左右氨芐青霉素(8毫克/毫升,0.02mol/L NaOH)在營養瓊脂平板上劃線,同時用等測菌液在同一平板上與氨芐青霉素交叉劃線.在同一平板上可鑒定幾種菌株,其中包括一種沒有R因子的對照菌株(如野生型),用以說明氨芐青霉素的效力.在37攝氏度培養12~24小時,無R因子者在兩線交叉處出現抑菌,有R因子者則無抑菌現象.亦可仿照鑒定rfa突變的方法,用浸有氨芐青霉素的濾紙片貼在已接種R因子待測菌株的平板上.若紙片周圍無抑菌圈,則表明對氨芐青霉素有抗性,即R因子存在. 
       
      pAQ1質粒鑒定——抗四環素試驗  方法類似R因子鑒定,四環素濃度為8毫克/毫升,0.02mol/L HCl,用量10μl. 
       
      自發回變鑒定  加0.1毫升待測菌液于含有2毫升上層培養基的試管中,混勻后鋪倒在底層基本培養基上.37攝氏度培養24小時,計數每皿自發的回變菌落數. 
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