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      微生物技術革蘭氏染色法

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


      微生物技術革蘭氏染色法

       
      一 目的要求
      了解革蘭氏染色的原理,學習并掌握革蘭氏染色的方法.
      二 基本原理
      革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的重要性狀.它是1884年由丹麥醫師Gram創立的.革蘭氏染色法(Gramstain)不僅能觀察到細菌的形態而且還可將所有細菌區分為兩大類:染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌,用G+表示;染色反應呈紅色(復染顏色)的稱為革蘭氏陰性細菌,用G-表示.
      細菌對于革蘭氏染色的不同反應,是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的.革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結構組成的,在染色過程中,當用乙醇處理時,由于脫水而引起網狀結構中的孔徑變小,通透性降低,使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色,因此,呈現藍紫色;革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低,而脂類物質含量高,當用乙醇處理時,脂類物質溶解,細胞壁的通透性增加,使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色,然后又被染上了復染液(番紅)的顏色,因此呈現紅色.
      革蘭氏染色需用四種不同的溶液:堿性染料(basicdye)初染液;媒染劑(mordant);脫色劑(decolorisingagent)和復染液(counterstain).堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣,而用于革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫(crystalviolet).媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力,即以某種方式幫助染料固定在細胞上,使不易脫落,碘(iodine)是常用的媒染劑.脫色劑是將被染色的細胞進行脫色,不同類型的細胞脫色反應不同,有的能被脫色,有的則不能,脫色劑常用95%的酒精(ethanol).復染液也是一種堿性染料,其顏色不同于初染液,復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色,而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色,從而將細胞區分成G+和G-兩大類群,常用的復染液是番紅.
       
      三 器材
      大腸桿菌,枯草芽孢桿菌;
      革蘭氏染色液,載玻片,顯微鏡等.
      四 操作步驟
      1.涂片將培養14至16小時的枯草芽孢桿菌和培養24小時的大腸桿菌分別作涂片(注意涂片切不可過于濃厚),干燥 固定.固定時通過火焰1至2次即可,不可過熱,以載玻片不燙手為宜.
      2.染色
      (1)初染加草酸銨結晶紫一滴,約一分鐘,水洗.
      (2)媒染滴加碘液沖去殘水,并覆蓋約一分鐘,水洗.
      (3)脫色將載玻片上面的水甩凈,并襯以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止,約20至30秒鐘,立即用水沖凈酒精.
      (4)復染用番紅液染1至2分鐘,水洗.
      (5)鏡檢干燥后,置油鏡觀察.革蘭氏陰性菌呈紅色,革蘭氏陽性菌呈紫色.以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準,過于密集的細菌,常常呈假陽性.
      (6)同法在一載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片,作革蘭氏染色對比.
      革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度,如脫色過度,則陽性菌可被誤染為陰性菌;而脫色不夠時,陰性菌可被誤染為陽性菌.此外,菌齡也影響染色結果,如陽性菌培養時間過長,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈陰性反應.
      五 實驗報告
      1.結果
      在你所作的革蘭氏染色制片中,大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色?它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌?
      2.思考題
      (1)作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚?其染色成敗的關鍵一步是什么?
      (2)當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時,怎樣能確證你的染色技術操作正確,結果可靠?
       
      革蘭氏(Gram)染色液
      1.草酸銨結晶紫染液
      A液:結晶紫(crystalviolet)2g
      95%酒精20ml
      B液:草酸銨(ammoniumoxalate)0.8g
      蒸餾水80ml
      混合A B二液,靜置48小時后使用.
      2.盧戈氏(Lugol)碘液
      碘片1.0g
      碘化鉀2.0g
      蒸餾水300ml
      先將碘化鉀溶解在少量水中,再將碘片溶解在碘化鉀溶液中,待碘全溶后,加足水分即成.
      3.95%的酒精溶液.
      4.番紅復染液
      番紅(safranineO)2.5g
      95%酒精100ml
      取上述配好的番紅酒精溶液10ml與80ml蒸餾水混勻即成.
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