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      細胞培養基質量標準及檢驗方法

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


       細胞培養基質量標準及檢驗方法
       
      一、 細胞培養基質量標準
       
      細胞培養基質量應符合表 1 所示的技術要求。
       
      表 1 技術要求

       

      二、 檢驗方法
      除非另有說明,檢驗中僅使用確認為分析純的試劑和中華人民共和國藥典 2010年版中規定的純化水。
       
      2.1澄清度的測定
      稱取每升標示量的實驗室樣品, 置于 1 000ml 燒杯中, 加水 950ml,攪拌至溶解, 補加水至 1000ml,
       
      拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010 年版二部附錄Ⅸ B 進行。
      2.2pH 值的測定
       
      稱取每升標示量的實驗室樣品, 置于 1 000ml 燒杯中, 加水 950ml ,攪拌至溶解, 補加水至 1000ml, 攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010 年版三部附錄Ⅴ A 進行。
      2.3干燥減量的測定
       
      按中華人民共和國藥典 2010 年版三部附錄Ⅶ L 干燥失重測定法進行。
       
      2.4滲透壓的測定
       
      稱取每升標示量的實驗室樣品, 置于 1 000ml 燒杯中, 加水 950ml ,攪拌至溶解, 補加水至 1000ml, 攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010 年版三部附錄Ⅴ H滲透壓摩爾濃度測定法進行。
      取兩次平行測定結果的算術平均值為測定結果,兩次平行測定結果的絕對差值不大于這兩個測定值的算術平均值的 5%。
      2.5細菌內毒素的測定
       
      按中華人民共和國藥典 2010 年版三部附錄Ⅻ E 細菌內毒素檢查法中的凝膠法進行。
       
      2.6微生物限度的測定
       
      按中華人民共和國藥典 2010年三部附錄Ⅻ G微生物限度檢查法進行,檢查項目為細菌數、霉菌數。檢 查法采用平皿法。
      2.7細胞生長試驗
       
      2.7.1貼壁型細胞生長試驗
       
      2.7.1.1方法提要
       
      1)本試驗所用容器具及溶液均為無菌,試驗操作過程均為無菌操作。
       
      2)細胞在 37℃恒溫條件下,在含體積分數   3%或 10%的小牛血清的細胞培養液中生長   72h,觀察細胞形態并進行細胞計數;細胞生長   72h 后,更換不含小牛血清的細胞培養液,繼續培養    48h,觀察細胞形態并進行細胞計數。
      2.7.1.2試劑和材料
       
      1)牛血清:符合中華人民共和國藥典 2010 年版三部附錄ⅩⅢ D。
       
      2)平衡鹽溶液: 稱取氯化鉀 0.2g ,精確至 0.01g ;無水磷酸二氫鉀 0.2g ,精確至 0.01g ;氯化鈉 8.0g ,精確至 0.01g ;無水磷酸氫二鈉 1.15g ,精確至 0.001g ;加純化水 1 000ml ,混勻,測 pH 值, pH 值應在
      7.5 ± 0.3 ,過濾除菌即得。
       
      3)細胞: vero 細胞(或根據不同的細胞培養基種類選擇適應的細胞 ): 細胞代次不超過 150 代。
       
      4)細胞培養液:按產品使用說明書要求配制;
       
      3) 胰蛋白酶溶液:稱取胰蛋白酶( 1:250 ) 2.5g ,精確至 0.01g ,加 1 000ml 平衡鹽溶液,混勻、測
       
      pH 值,用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 調 pH 值 7.6 ~ 7.8 ,過濾除菌即得。
       
       
      4
       
      2.7.1.3儀器
       
      1)醫用凈化工作臺:潔凈級別為百級 .
       
      2)二氧化碳恒溫培養箱: 能通二氧化碳氣體并且保持二氧化碳體積分數為 (5±0.1 )%,能在(37±1)℃恒溫。
      3)細胞培養瓶: T25 型、無菌。
       
      4)顯微鏡:倒置、相差。
       
      5)血球計數板。
       
      6)蓋玻片:無水乙醇浸泡并擦干。
       
      2.7.1.4試驗步驟
       
      1)制備細胞懸液
       
      A 取長成致密單層的細胞種子, 將原細胞培養液從細胞培養瓶內吸出, 用適量平衡鹽溶液洗細胞一次,棄洗液(去除死細胞) 。
      B 向細胞培養瓶內加入胰蛋白酶溶液 1ml ,消化一定時間,在顯微鏡下觀察 , 當細胞變圓接近脫壁時,將胰蛋白酶溶液倒掉。
      C 根據細胞數量加入一定量細胞培養液,用吸管吹打,使細胞脫壁制成細胞懸液 A。
       
      2)細胞培養
       
      A 吸取一定量的細胞懸液 A,加到細胞培養瓶內。
      B 向細胞培養瓶內加至 10ml 含體積分數為 3%或 10%的小牛血清的細胞培養液,使細胞接種數量為 5
       
      × 10 細胞 /ml 。
       
      C 將細胞培養瓶送入培養箱,在( 37±1)℃溫度條件及( 5±0.1 )%二氧化碳條件下進行培養。
       
      D 培養 72h,觀察細胞形態,按照 2.7.1.4 步驟 1)方法制備細胞懸液,進行活細胞計數。
       
      E 培養 72h后,更換不含牛血清的細胞培養液 10ml ,繼續培養 48h,觀察細胞形態,按照 2.7.1.4 試驗步驟 1)方法制備細胞懸液,進行活細胞計數。
      3)細胞計數
       
      A將需要計數的細胞按按照 2.7.1.4 步驟 1)方法制備細胞懸液 B。
       
      B吸取細胞懸液 B100μ l 轉移至離心管中,視細胞量確定是否稀釋及稀釋倍數。
       
      C 將蓋玻片蓋于計數板中心的計數室上方。調整計數板中的細胞數量在( 100~ 300)個。沿蓋玻片邊緣點加細胞懸液使其通過毛細作用自然滲入,不要留有氣泡,不要外溢,顯微鏡下計數。
      D 觀察計數板四角大方格中的細胞數,細胞壓中線時,一般遵循“計左不計右,計上不計下”的原則。將計數板觀察細胞數代入下列公式:
      計數板觀察細胞數× 10 ×稀釋倍數 /4 =細胞數 /ml
       
      2.7.1.5 分析結果的表述
      培養 72h的細胞, 細胞形態應正常, 活細胞數量應達到 1×10
      5 個/ml 以上。 繼續維持培養 48h的細胞形態
      應正常,活細胞數量應不小于 1×10
      5 個/ml 以上。
      2.7.2  懸浮型細胞生長試驗
      2.7.2.1  方法提要
      本試驗所用容器具及溶液均為無菌,試驗操作過程均為無菌操作。
      細胞在 37℃恒溫條件下,在細胞培養液中懸浮生長 72h,觀察細胞形態,進行 72h細胞計數。
      2.7.2.2  試劑和材料
      1)細胞:已適應待檢細胞培養基的懸浮細胞株。
      2)細胞培養液:按產品使用說明書要求配制;
      2.7.2.3 儀器
      1) 醫用凈化工作臺:潔凈級別為百級;
      2) 恒溫震蕩培養箱:能在( 37± 1)℃恒溫;
      3) 細胞培養瓶: 250ml 搖瓶,應無菌;
      4) 顯微鏡:倒置、相差;
      2.7.2.4 細胞培養
      1)用方瓶或搖瓶擴增細胞;
      2)離心細胞,用待測細胞培養液重懸細胞,計數,計算出所需要的細胞數;
      3)將細胞轉至搖瓶中,細胞數量接種數量為 2.5 × 10
      5 個/ml ,加液量 20ml左右;
      4)將搖瓶細胞移至恒溫培養箱中培養,轉速 90~100rpm,溫度 37℃;
      5)培養 72h,記錄細胞數量和活率(采用 0.4%的臺盼藍染色法計數及計算活率)。
      2.7.2.5  細胞活率計算
      1) 細胞染色:取吸管 1支,伸入培養瓶中,輕輕反復吹打細胞懸液使細胞重懸均勻后,立即吸細胞懸
      液少許,向另一離心管中滴入細胞懸液 1份,再滴入臺盼藍染液 1份,混勻,置 2~3分鐘。
      2) 計數:按 2.7.1.4 步驟 1 )進行。鏡下觀察可見細胞分散各處,健康細胞胞體完整,透明不著色,
      凡著色細胞均為死細胞。記錄活細胞數及細胞總數。
      3)活率計算 細胞活率 % =(活細胞數量 / 細胞總數)× 100%
      2.7.2.6  分析結果的表述
      懸浮培養 72h的細胞形態應正常,培養 72h細胞數量應達到 1.0 ×10
      6 個/ml 以上 , 活率應達到 90%以上。
      2.8 牛血清白蛋白殘留量
      依據中華人民共和國藥典 2010 年三部附錄Ⅷ I 牛血清白蛋白殘留量測定法進行,不得檢出牛血清白
      7
      蛋白。
      2.9 抗生素殘留量
      依據中華人民共和國藥典 2010年三部附錄Ⅸ A抗生素殘留量測定法進行,不得檢出青霉素、鏈霉素及

       

      慶大霉素。
       
      來自:日水培養基qdrishui.cn

       

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