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      細菌的鞭毛染色方法步驟和應用事項

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


      細菌的鞭毛染色方法

      細菌的鞭毛極細,直徑一般為10—20nm,只有用電子顯微鏡才能觀察到.但是,如采用特殊的染色法,則在普通光學顯微鏡下也能看到它.鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先用媒染劑處理,讓它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然后再進行染色.常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成.現推薦以下兩種染色法.
      一、實驗器材
      1.活材料:培養12-16h的水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae),粘質賽氏桿菌(Serratia marcescens)或假單細胞菌(Pseudomonas sp.)斜面菌種.2.染色液和試劑:硝酸銀染色液Leifson染色液、香柏油、二甲苯.3.器材:載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環,顯微鏡.
      二、實驗方法
      1.鍍銀法染色
      (1)清洗玻片  選擇光滑無裂痕的玻片,最好選用新的.為了避免玻片相互重疊,應將玻片插在專用金屬架上,然后將玻片置洗衣粉過濾液中(洗衣粉煮沸后用濾紙過濾,以除去粗顆粒),煮沸20分鐘.取出稍冷后用自來水沖洗、晾干,再放入濃洗液中浸泡5—6天,使用前取出玻片,用自來水沖去殘酸,再用蒸餾水洗.將水瀝干后,放入95%乙醇中脫水.(2)菌液的制備及制片:菌齡較老的細菌容易失落鞭毛,所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上(培養基表面濕潤,斜面基部含有冷凝水)連續移接3-5代,以增強細菌的運動力.最后一代菌種放恒溫箱中培養12—16h.然后,用接種環挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環,移至盛有1—2mL無菌水的試管中,使菌液呈輕度混濁.將該試管放在37恒溫箱中靜置10分鐘(放置時間不宜太長,否則鞭毛會脫落),讓幼齡菌的鞭毛松展開.然后,吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端,立即將玻片傾斜,使菌液緩慢地流向另一端,用吸水紙吸去多余的菌液.涂片放空氣中自然干燥.用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養基培養.方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養基熔化后倒入無菌平皿中,待凝固后在平板細菌檢測沉降碟平板圖片中央點接活化了3-4代的細菌,恒溫培養12-16h后,取擴散菌落的邊緣制作涂片.(3)染色
      滴加A液,染4—6分鐘.用蒸餾水充分洗凈A液.用B液沖去殘水,再加B液于玻片上,在酒精燈火焰上加熱至冒氣,約維持0.5—1分鐘(加熱時應隨時補充蒸發掉的染料,不可使玻片出現干涸區).用蒸餾水洗,自然干燥.
      (4)鏡檢:先低倍,再高倍,最后用油鏡檢查.結果:菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色.
      2.改良Leifson染色法
      (1)清洗玻片法同1.(2)配制染料  見附錄二(一)9.染料配好后要過濾15-20次后染色效果才好.(3)菌液的制備及涂片菌液的制備同1.用記號筆在潔凈的玻片上劃分3—4個相等的區域.放1滴菌液于第一個小區的一端,將玻片傾斜,讓菌液流向另一端,并用濾紙吸去多余的菌液.干燥  在空氣中自然干燥.
      (4)染色
      加染色液于第一區,使染料覆蓋涂片.隔數分鐘后再將染料加入第二區,依此類推(相隔時間可自行決定),其目的是確定最合適的染色時間,而且節約材料.水洗:在沒有傾去染料的情況下,就用蒸餾水輕輕地沖去染料,否則會增加背景的沉淀.干燥:自然干燥.
      (5)鏡檢  先低倍觀察,再高倍觀察,最后再用油鏡觀察,觀察時要多找一些視野,不要企圖在1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛.結果:菌體和鞭毛均染成紅色.
      三、注意事項
      1.鍍銀法染色比較容易掌握,但染色液必須每次現配現用,不能存放,比較麻煩.2.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響,且染色液須經15-20次過濾,要掌握好染色條件必須經過一些摸索.3.細菌鞭毛極細,很易脫落,在整個操作過程中,必須仔細小心,以防鞭毛脫落.4.染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件.
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