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      雙歧桿菌的分離培養及鑒定

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


      雙歧桿菌的分離、培養及鑒定

       
      實驗目的
      掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法.觀察雙歧桿菌的形態特征并了解雙歧桿菌的生長特性.了解雙歧桿菌鑒定的一般方法.
       
      基本原理
      厭氧微生物在自然界分布廣泛,種類繁多,其生理作用日益受到人們的重視.雙歧桿菌是專性厭氧菌,對氧氣非常敏感,因此,雙歧桿菌的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境.
       
      雙歧桿菌的最適生長溫度37至41,最低生長溫度25至28,最高43至45.初始最適pH 6.5至7.0,在pH4.5至5.0或pH 8.0至8.5不生長.其細胞呈現多樣形態,有短桿較規則形、纖細桿狀具有尖細末端形、球形、長桿彎曲形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形.單個或鏈狀、V形、柵欄狀排列,或聚集成星狀.革蘭氏陽性,不抗酸,不形成芽孢,不運動.雙歧桿菌的菌落光滑、凸圓、邊緣完整、乳脂至白色、閃光并具有柔軟的質地.雙歧桿菌是人體內的正常生理性細菌,定殖于腸道內,是腸道的優勢菌群,占嬰兒消化道菌叢的92%.該菌與人體終生相伴,其數量的多少與人體健康密切相關,是目前公認的一類對機體健康有促進作用的代表性有益菌.該菌可以在腸粘膜表面形成一個生理性屏障,從而抵御傷寒沙門氏菌、致瀉性大腸桿菌,痢疾志賀氏菌等病原菌的侵襲,保持機體腸道內正常的微生態平衡;能激活巨噬細胞的活性,增強機體細胞的免疫力;能合成B族維生素、煙酸和葉酸等多種維生素;能控制內毒素血癥和防治便秘,預防貧血和佝僂病;可降低亞硝胺等致癌物前體的形成,有防癌和抗癌作用;能拮抗自由基、羥自由基及脂質過氧化,具有抗衰老功能.
       
      雙歧桿菌的培養方法很多,如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法.這些方法都需要特定的除氧措施,操作步驟多,較繁瑣.本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法:亨蓋特厭氧滾管技術,亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術 .以后這項技術又經歷了幾十年的不斷改進,從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善,并逐漸發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術,而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術.該技術的優點是:預還原培養基制好后,可隨時取用進行試驗;任何時間觀察或檢查試管內的菌都不會干擾厭氧條件.
       
      目前,雙歧桿菌鑒定的方法有很多種.近年來興起的一種新的RAPD等分子生物學技術對雙歧桿菌進行基因指紋圖譜的構建,分析不同雙歧桿菌種間存在的同源性和多態性;RAPD技術也可用于雙歧桿菌菌種鑒定及分型.一般來講,我們都應用適合鑒定所有厭氧菌的方法,主要包括雙歧桿菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機酸的測定、糖發酵試驗和其他相關指標等.
       
      實驗用具
      高純氮氣厭氧管 注射器 培養箱冰塊 水浴鍋鑷子 記號筆 MRS培養基細菌生化微量鑒定管 酒精棉球 瓷盤振蕩器 銅柱除氧系統 定量加樣器 恒溫水浴 載玻片 顯微鏡 恒溫培養箱 超聲波破碎儀 濾紙 層析缸 酒精燈 封口膜 厭氧罐 等.
       
      實驗方法與步驟
       
      銅柱系統除氧
      銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管.此管的大小為40至400mm,兩端被加工成漏斗狀,外壁繞有加熱帶,并與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度.銅柱兩端連接膠管,一端連接氣鋼瓶,另一端連接出氣管口.由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2 和H2等都含有微量O2,故當這些氣體通過溫度約360的銅柱時,銅和氣體中的微量O2化合生成CuO,銅柱則由明亮的黃色變為黑色.當向氧化狀的銅柱通入H2時,H2與CuO中的氧就結合形成H2O,而CuO又被還原成了銅,銅柱則又呈現明亮的黃色.此銅柱可以反復的使用,并不斷起到除氧的目的.當然H2源也可以由氫氣發生器產生.
       
      預還原培養基及稀釋液的制備
      制作預還原培養基及稀釋液時,先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧,而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,一般瓊脂培養基裝4.5至5.0毫升,稀釋液裝9毫升,并插入通N2氣的長針頭以排除O2.此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色,說明試管內已成為無氧狀態,然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,滅菌備用.
       
      分離
      編號,取五支無菌水試管,分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5.
      稀釋
      在無菌條件下,用無菌注射器吸取1毫升混合均勻的液體樣品,加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中,用震蕩器將其混合均勻,制成10-1稀釋液.用無菌注射器吸取1毫升10-1稀釋液至另一裝有9毫升生理鹽水的厭氧試管中,制成10-2稀釋液.依此進行10倍系列稀釋,至10-7,制成不同樣品稀釋液.通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管計數.
       
      滾管分離
      滾管
      將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化,置46-50恒溫的水浴中,待用,用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1毫升,分別注入待用的試管中,然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動,帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層.
       
      分離
      生成的菌落需挑取出來,鏡檢其形態及純度.如尚未獲得純培養物,需再次稀釋滾管,并再次挑取菌落,直至獲得純培養物為止.待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定,做好標記.然后將培養基試管固定于適當的支架上,打開試管膠塞,同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內.同時,另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭.將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內,找準待挑菌落,輕輕吸取,轉移至液體試管內,加塞.37培養.培養24h或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度.
       
      計數并鏡檢
      計數
      液體純培養物經系列稀釋后,按上述滾管法培養.然后對固體滾管計數,計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數量.公式如下:
      雙歧桿菌數量cfu/g(毫升)樣品=0.1毫升滾管計數的實際平均值×10×稀釋倍數
       
      鏡檢
      挑取特征性菌落制片,革蘭氏染色后鏡檢,觀察菌體形態.
       
      菌種鑒定
      雙歧桿菌特定酶的檢測
      利用果糖-6-磷酸鹽對分離得到的菌種進行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶(F6PPK)的測定,初步確定菌種是否為雙歧桿菌屬.F6PPK測定的操作如下:
      將從樣品中分離出的雙歧桿菌培養于厭氧液體改良MRS培養基中37生長24h.
      將菌液4400rpm離心10分鐘,收集菌體,緩沖液洗滌2次,最后溶于約4 毫升緩沖液中,制成細菌懸液.
       
      緩沖液
      現用現配.取0.05M Na2HPO4 31.5 毫升和0.05M NaH2PO4 68.5毫升,再加500毫克/L半胱氨酸-鹽酸鹽.
      用超聲波粉碎儀,400 W條件下;每處理5 s、間隔5s,超聲粉碎8分鐘,至菌體溶液呈半透明.
      破碎后,取0.5毫升于離心管中,加試劑和各125μL,37保溫30分鐘.
      6毫克/毫升氟化鈉加10毫克/毫升 碘乙酸鈉.
      果糖-6-磷酸鹽80毫克/毫升水溶液.
      加試劑 0.750毫升, 室溫10分鐘.
      現用現配.鹽酸羥胺139 毫克/毫升.酸性極強,用氫氧化鈉中和至pH6.5.
      加試劑和各500μL, 室溫5分鐘.
      三氯乙酸(TCA)水溶液15g/100 毫升.
      4 M HCl.
      加試劑500μL, 顯色.紅褐色或紅紫色為陽性,黃色為陰性.
      0.5 g/100毫升 FeCl3·6H2O溶于0.1 M HCl.
       
       乙酸、乳酸等有機酸的測定:紙層析法
      層析濾紙的制備:將層析濾紙剪成1.5cm*11cm的長條狀,在距層析紙一端約4cm處用鉛筆劃線確定點陽線,使用前充分干燥.
      配制展開劑:正丁醇:甲酸:水=80:15:5
      配制標準液:配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液
      制備待測樣品:將菌種37培養24h后離心,收集上清液
      點樣:用毛細管分別吸取發酵液,多次點樣于濾紙條上,樣點直徑不宜超過2mm,平衡2h
      層析:將點好樣的層析紙放入,使點有樣品的一端浸在展開劑中,但不可浸及樣點.觀察展開情況,待展開劑前沿到達離層析紙另一端約1.5cm處,取出層析紙.
      顯色:以3%溴甲酚藍酒精溶液為顯色劑,待層析液揮發之后,向層析濾紙噴灑并計算Rf值.
       
      注釋:物質被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值 (比移值 Rf value 又稱Rf值) 來表示:
      Rf = 原點到層析中心的距離 / 原點到溶劑前沿的距離
      在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關,是一個定性分析的重要參數.
       
      糖發酵試驗
      糖發酵實驗是最常用的生化反應,在腸道細菌鑒定上尤為重要.絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖的能力上有很大差異,有些細菌能分解糖并產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣,不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣,不能分解乳糖.酸的產生可以利用指示劑來斷定.在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)],當發酵產酸時,可使培養基由紫色變為黃色.氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明.
       
      本實采用現成的細菌生化微量鑒定管 ,鑒定管的種類如下:
      乳糖麥芽糖 甘露糖甘露醇蔗糖阿拉伯糖 D-核糖木糖(木膠糖) 半乳糖松三糖 山梨糖淀粉水楊素葡萄糖酸鹽草糖(海藻糖) 血清菊糖棉子糖果糖蜜二糖纖維二糖
       
      具體實驗步驟:
      將菌液進行適當稀釋,之后在無菌環境下,取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中,用無菌封口膜封口.將接種后的鑒定管放入厭氧罐中,充足氮氣后放入37恒溫培養箱培養.24h后觀察各管中液體變顏色情況,若變色則為陽性,反之陰性,對照凌代文編著的《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》“鑒別雙歧桿菌屬內種的特征”表即可初步確定其種別.
       
      注意事項
      注射器在使用前必須經過121、20分鐘滅菌.
      注意無菌操作,保持手和培養管的清潔.每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍.
      用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后,如需再次吸取,應快速將注射器插入厭氧管中,以防止針頭污染.
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