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      微生物實驗:抗生素敏感試驗

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:

      微生物實驗室培養常用培養基


      抗生素敏感試驗

      瓊脂擴散法敏感試驗(改良Kirby-Bauer法)
      若只根據是否出現抑菌環而不考慮抑菌環的直徑大小,來判斷細菌是否對抗菌藥物敏感的實驗方法,其結果是不正確的.而紙片擴散法試驗是應用標準的方法學原理,根據抑菌環直徑大小與最低抑菌濃度的相關性,結合臨床上已知敏感或耐藥菌株的狀態,其結果是可靠的.WHO推薦K-B法,其目的在于技術的簡單和可重復性.本法特別適用于腸桿菌科細菌,也可用于快速生長的致病菌,但不適用于其他細菌,如嗜血桿菌、奈瑟菌、專性厭氧菌及酵母樣菌等.無論用哪種方法接種,只要質控菌株的抑菌環在預期范圍內,均可按同一解釋標準報告結果.但并非從感染患者分離到的微生物都必須做敏感試驗,對于污染、機體共生的正常細菌群和那些與感染無關的細菌,可不必做敏感試驗,只有那些被認為引起感染的微生物,應先分純、鑒定菌種后再做敏感試驗.
       
      試驗用材料
       
      Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton瓊脂.多年大量的有關敏感試驗的方法學研究,均采用該培養基,維持細菌正常發育,絕大多數細菌在此培養基上生長良好.此培養基不拮抗抗菌藥物活性以及商品的批間差異等方面均優于其他培養基.若檢測肺炎鏈球菌的敏感性時,在培養基中加5%的脫纖維羊血,制成血平板.測嗜血桿菌及淋病奈瑟菌的敏感性時,在培養基中須加入1%血紅素和2.5mg/毫升輔酶I后應校正pH7.2至7.4.
      制備MH瓊脂平板應用直徑90cm平皿.在水平的實驗臺上傾制.瓊脂厚為4毫米,允許誤差為土l毫米.瓊脂凝固后,應測一下pH是否正確.瓊脂于板應放4攝氏度保存,在7日內用完.
       
      藥物紙片
      抗菌藥物紙片直徑約為6.00至6.35毫米,每片的吸水量約20μl.采用K-B法,紙片的藥物含量必須與該法規定的一致,不得任意更改.藥物紙片可以購買,也可自制,用前必須做質量鑒定.用以下兩個指標判定紙片的質量:
      片間差:是衡量不同紙片含藥是否均一的指標.測定方法:以質控菌株接種M-H瓊脂平板,一塊平板上貼6張相同的紙片.35C過夜,培養后,記錄6個抑菌直徑,其最大和最小之差不應大于1至2毫米.
      準確度:判定紙片的實際含藥量與標量是否一致.
      紙片的合理保存十分重要.藥物紙片必須在有干燥劑的容器內低溫(-10攝氏度以下)保存.只拿出少量放4攝氏度備日常工作用.裝紙片的容器從冰箱取出后,必須在室內溫暖l0分鐘以上才可打開.如立即打開,空氣中的水分會冷凝在紙片上,容易潮解.
      細菌實驗室應按臨床的需要,決定敏感試驗抗菌藥物的種類.同類抗菌藥物僅選用一個代表.應根據測定細菌的屬種選藥.
       
      質控菌株
      K—B法質量控制用菌株常規用:金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853.測定MH瓊脂是否適合做磺胺類試驗,須用糞鏈球菌ATCC29212或33186.上述質控菌株應由衛生部臨床檢驗中心供應.實驗室保存菌株可用凍干法或保存在高層瓊脂中.常規質量控制菌株應每月更換1次.
      質控菌株簡便保存方法:將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復活.然后每株細菌接種10支高層瓊脂管,放置冰箱保存.每月取1支,傳種細菌供常規使用.待用剩至最后1支,再傳代在M-H平板上,接種一批高層瓊脂管備用.如此連續可避免原始菌種不接觸抗生素,以防變異.
       
      菌液比濁管
      為保證敏感試驗的準確度和精密度,必須對接種菌液的濃度做相應控制.采用比濁的辦法控制菌懸液濃度.接種菌液濃度為1.5×l08/m1,濁度相當于麥氏標準比濁管第1號管的1/2.
      比濁管配法如下:
      0.048mol/LBaCl20.5毫升
      0.18mol/LH2SO499.5毫升
      將二液置冰水浴中冷卻后混合,置螺口試管中,放室溫暗處保存.用前混勻.有效期為6個月.
       
      操作方法
      1,制備接種菌液:臨床標本中分離的細菌做藥敏試驗,應挑取已分純的菌落4至5個制備菌懸液.
      制備菌液的方法是挑選瓊脂平板上、形態相同的菌落移種于M—H液體培養基中,置35攝氏度水箱中孵育4小時,校正濁度,或用接種環挑取菌落,懸浮于生理鹽水中,振蕩混勻后與標準比濁管比濁,以有黑字的白紙為背景,調整濁度與比濁管相同.此法制備接種菌液適用于任何細菌.
      2,接種平板:制備好的接種菌液必須在15分鐘內使用.用滅菌的棉拭子蘸取菌液:在管壁上旋轉擠壓幾次,去掉過多的菌液.用拭子涂布整個培養基表面,反復幾次,每次將乎板旋轉60°,最后沿平皿周邊繞兩圈,保證涂布均勻.
      3,貼紙片:須待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片.用鑷子取紙片一張,貼在瓊脂平板表面,用鑷尖壓一下,使其貼平,紙片一貼就不可再拿起,因紙片中的藥物已擴散到瓊脂中.每張紙片間距不少于24毫米,紙片中心距平皿邊緣不少于15毫米.直徑為90毫米的平板最好貼6張.貼上紙片后,須在15分鐘內放35攝氏度孵箱培養.不可放在CO2環境中.
      4,孵育:必須用35攝氏度孵箱,平板在孵箱內最好單獨擺放,不超過二個疊在一起,否則中間的平板,達不到孵箱溫度而產生預擴散的作用,平板孵育18至24h后,讀取結果.
      5,判定結果:培養后取出平板,測量抑菌環的直徑.抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限.有的菌株可出現蔓延生長,進入抑菌環,磺胺藥在抑菌環內會出現輕微生長,這些都不作為抑菌環的邊緣.
      按抑菌環直徑判斷細菌的敏感性,應依據所提供的解釋標準,報告結果必須明確中介的含意,加以區別.
       
      瓊脂稀釋法敏感試驗
       
      概述
      瓊脂稀釋法敏感試驗是將不同劑量的抗菌藥物,分別加于融化并冷至45攝氏度的定量瓊脂培養基中,混勻,傾注成無菌平板,即為含有藥物濃度遞減的培養基.接種幼齡菌于該培養基上,經培養后觀察被檢菌的生長情況,最低藥物濃度抑制細菌生長者為該菌的最低抑菌濃度.其優點是:
      1.比液體稀釋法重復性好:
      2.每個平板同時測定多株細菌:
      3.可觀察被檢菌集落生長良好與否:
      4.發現被污染的菌落:
      5.可引用機械化手段,提高效率.
       
      材料和試驗方法
      1.抗菌藥物原液的配制:配制各種抗菌藥物原液的溶劑及稀釋劑.
      2.抗生素稀釋.
      3.培養基的制備及貯存:培養基為MH瓊脂,按廠家規定進行配制時加水量要減少l/10,以備留給補充稀釋好的抗生素用,121攝氏度15分鐘滅菌,水浴中冷卻至48至50攝氏度:100毫米平皿加一個濃度的抗生素2.5毫升,再加入MH瓊脂25毫升(刻度燒杯量),充分混勻.已配制含有抗生素瓊脂平板,應放在塑料袋內,4至8攝氏度中保存,用于質控試驗平板,只能保存5天,常規試驗時,略可延長使用時間.
      4.接種方法:為獲得準確的MIC結果,接種被檢菌數量,必須控制在規定范圍內,即每個斑點中應含104CFU.制備方法如下:挑選過夜瓊脂上培養物4至5個菌落接種于4至5mi肉湯中(如M—H肉湯、腦心浸液肉湯等).35攝氏度培養至微混濁,再調節至0.5號麥氏管濃度(108CFU/m1).也可挑選過夜生長的瓊脂上純菌落,直接用鹽水稀釋比濁到0.5號麥氏管濃度.再1:10稀釋成為107CFU/毫升,30分鐘內,將上述被檢菌株懸液接種至含抗生素的一系列平板上.接種方法有多種,最好是用接種器,一次可接種大約36個菌株,每根針約可傳種2μl菌液.接種前平板必須相當干燥,操作時從最低濃度的瓊脂平板種起.為了核對每個被驗菌株的生長或污染狀況,最后還需點種一個不含抗生素的對照平板:即將每株被檢菌懸液,用定量加液器吸取1μl菌液,接種在1/2無抗生素的M-H瓊脂平皿上,充分劃線,第二日觀察有否污染,菌落計數,菌數大約為104CFU/毫升.
      每次檢測要用質控菌種跟隨操作.
      5.孵育:接種好的平板,放置室溫讓接種液被充分吸干后,置35,C溫箱內16至20h讀取結果.特殊菌種的抗生素敏感試驗所需要的條件見另節.
       
      讀取結果及報告
      首先讀質控平板的MIC,然后讀取被檢菌株測定的MIC值:在前后二個不同梯度濃度的抗生素M-H瓊脂平板上,細菌生長數量有80至90%的突然減少為結果終點,即MIC值.
      有幾點要注意的:薄霧狀生長不算:<5個菌落不算:若在數個平板上呈拖尾或跳管生長等現象,應該重做.
      MIC單位為μg/毫升,根據MIC值參照表,報告相應的敏感或耐藥結果,或同時將MIC值附在敏感或耐藥后面.
      在測定同時,可用質控菌株檢測MIC,以控制本次實驗的準確性.
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