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      志賀氏菌屬及檢驗方法

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:

      培養基生產廠家


      志賀氏菌屬及檢驗方法
       
      志賀氏菌屬(Shigella)的細菌(通稱痢疾桿菌),是細菌性痢疾的病原菌.臨床上能引起痢疾癥狀的病原生物很多,有志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌、大腸桿菌等,還有阿米巴原蟲、鞭毛蟲、以及病毒等均可引起人類痢疾,其中以志賀氏菌引起的細菌性痢疾最為常見.人類對痢疾桿菌有很高的易感性.在幼兒可引起急性中毒性菌痢,死亡率甚高.
       
      生物學性狀
      志賀氏菌屬細菌的形態與一般腸道桿菌無明顯區別,為革蘭氏陰性桿菌,長約2-3μm,寬0.5-0.7μm.不形成芽胞,無莢膜,無鞭毛,有菌毛.DNA的G+C為49-53克分子%(Tm法).
      需氧或兼性厭氧.營養要求不高,能在普通培養基上生長,最適溫度為37攝氏度,最適pH為6.4-7.8.37攝氏度培養18-24小時后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊緣整齊,直徑約2nm,宋內氏菌菌落一般較大,較不透明,并常出現扁平的粗糙型菌落.在液體培養基液體培養基的圖片中呈均勻渾濁生長,無菌膜形成.
      本菌屬都能分解葡萄糖,產酸不產氣.大多不發酵乳糖,僅宋內氏菌遲緩發酵乳糖.靛基質產生不定,甲基紅陽性,VP試驗陰性,不分解尿素,不產生H2S.根據生化反應可進行初步分類.
       
      志賀氏菌屬的細菌對甘露醇分解能力不同,可分為二大組.
      A、不分解甘露醇組:主要為志賀氏菌.又根據能否產生靛基質,進一步分靛基質陽性(1、3、4、5、6、9、10型)和靛基質陰性(2、7、8型)的志賀氏痢疾菌.
      B、分解甘露醇組:包括福氏、鮑氏、宋內氏菌.再按乳糖分解情況,分為遲緩分解乳糖的宋內氏和不分解乳糖的福氏和鮑氏菌.后者進一步再根據靛基質產生與否,分靛基質陽性(福氏菌1、2、3、4、5型和鮑氏菌5、7、9、11、13、15型)和靛基質陰性(福氏菌6型和鮑氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14)二類
       
      抗原構造與分型:志賀氏菌屬細菌的抗原結構由菌體抗原(O)及表面抗原(K)組成.主要抗原有三種.
      型特異性抗原:型多糖抗原為菌體抗原的一種,是光滑型菌株所含有的重要抗原.當菌株變為粗糙型時,此抗原也常隨之消失,各菌型所含的型抗原不同,可用于區別菌種的型別.
      群特異性抗原:為光滑型菌株的次要抗原,也是菌體抗原的一種.特異性較低,常在數種近似的菌內出現.在福氏菌株中,由于所含群抗原不同,可將某些菌型分為多種亞型,如福氏菌2型,根據群抗原不同,可分成2a、2b兩個亞型.
      表面抗原(K抗原):在新分離的某些菌株菌體表面含有此種抗原.不耐熱,加熱100攝氏度1小時即被破壞.具有此種抗原的菌株,可阻止菌體抗原與相應免疫血清發生凝集.
       
      A群:也稱志賀氏菌群,有10個血清型.不發酵甘露醇,無鳥氨酸脫羧酶,與其他各群細菌無血清學聯系.
      B群:也稱福氏菌群,已有13個血清型(包括亞型和變種).最近又發現3個亞型(1c、4c、5b).發酵甘露醇,無鳥氨酸脫羧酶.抗原結構較復雜,各型間有交叉凝集.每一福氏菌型具有二種抗原,即型特異性抗原和群抗原,前者只存在于同型菌株中,后者有許多種,存在于福氏各菌型中.例如福氏1b型除含有1型特異性抗原外,尚含有4、6群抗原.
      C群:也稱鮑氏菌群,有15個血清型,分解甘露醇,無鳥氨酸脫羧酶.各型內無交叉凝集.
      D群:也稱宋內氏菌群,僅有一個血清型.分解甘露醇,有鳥氨酸脫羧酶,遲緩發酵乳糖.有Ⅰ、Ⅱ相之分.
       
      抵抗力:志賀氏菌屬在外界環境中的生存力,以宋內氏最強,福氏菌次之,志賀氏菌最弱.一般在潮濕土壤中能存活34天,37攝氏度水中存活20天,在冰塊中可存活96天,在糞便內(室溫)存活11天.日光直接照射30分鐘,56-60攝氏度10分即被殺死,對高溫和化學消毒劑很敏感,1%石炭酸中15-30分鐘即被殺死,對氯霉素、磺胺類、鏈霉素敏感,但易產生耐藥性.
       
      變異性:
      S-R型變異:菌落可由光滑型變為粗糙型,同時常伴有生化反應、抗原構造和致病性的變異.在機體內,尤其在慢性患者和恢復期患者,志賀氏菌可發生變異而失去原來的生化和抗原特性,成為不典型菌株.但其中部分不典型菌株,可通過10%膽汁肉湯等返祖為典型菌株.故在慢性患者或帶菌者糞便檢查時,對這類菌株要特別注意,必須多次反復檢查.因這對傳染源的發現及控制有重要意義.
      耐藥性變異:自從廣泛使用抗菌素以來,志賀氏菌的耐藥菌株不斷增加,給防治工作帶來許多困難.國內部分地區報道(1972-1974),志賀氏菌對四環素的耐藥率達74%、氯霉素73.6-97%、鏈霉素84-98%、合霉素75-100%、磺胺類97-100%,可見國內對常用幾種抗菌素的耐藥率相當高.
      毒力變異與其他變異:1963年南斯拉夫Mel氏首先創用依賴鏈霉素的志賀氏菌株(依鏈Sd株,口服預防痢疾.Sd株是一株必須有鏈霉素存在下才能生長的菌株,其毒力減弱但仍保持免疫原性.美國以天然變異無毒株與大腸桿菌雜交而獲得的MH株制成疫苗,其免疫效果和穩定性均較Sd株差.我國正大力利用變異方法通過動物和藥物處理等尋找安全有效可供口服的痢疾桿菌活菌苗,并已取得初步成效.
       
      與E.coli的鑒別:志賀氏菌與E.coli的區別,的確是很困難的,這也反映了這二者在DNA_DNA雜交顯示密切相關性,實質是“同一種”.A.培養物常常是不運動的,賴氨酸是陰性.B.除了福氏志賀氏6、鮑氏志賀氏13和14、痢疾志賀氏3少數菌株外,在糖發酵時不產氣.C.發酵粘液酸或乙酸鹽洋菜上或Chiristensen檸檬酸洋菜.如呈堿反應的菌株則類似與E.coli.D.鮑氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌在美國很少見.
       
      流行病學:
      人和靈長類是志賀氏菌的適宜宿主,營養不良的幼兒、老人及免疫缺陷者更為易感.據報道,每年約有14000例志賀氏菌病,但估計發病人數為30萬.
      據FDA統計,1997年美國加州等5個州食源性疾病共為8051例,其中志賀氏菌引起的為1263例.
      志賀氏菌病常為食物爆發型或經水傳播.和志賀氏菌病相關的食品包括色拉(土豆、金槍魚、蝦、通心粉、雞),生的蔬菜,奶和奶制品,禽,水果,面包制品,漢堡包,和有鰭魚類.志賀氏菌在擁擠和不衛生條件下能迅速傳播,經常發現于人員大量集中的地方如餐廳、食堂.食源性志賀氏菌流行的最主要原因是從事食品加工行業人員患菌痢或帶菌者污染食品,食品接觸人員個人衛生差,存放已污染的食品溫度不適當等.
       
      致病性:
      志賀氏菌引起的細菌性痢疾,主要通過消化道途徑傳播.根據宿主的健康狀況和年齡,只需少量病菌(至少為10個細胞)進入,就有可能致病.
      致病因素:志賀氏菌的致病作用,主要是侵襲力、菌體內毒素個別菌株能產生外毒素.
      侵襲力:志賀氏菌進入大腸后,由于菌毛的作用粘附于大腸粘膜的上皮細胞上,繼而進入上皮細胞并在內繁殖,擴散至鄰近細胞及上皮下層.由于毒素的作用,上皮細胞死亡,粘膜下發炎,并有毛細吸管血栓形成以至壞死、脫落,形成潰瘍.志賀氏菌一般不侵犯其他組織,偶爾可引起敗血癥.目前認為不論是產生外毒素的還是只有內毒素的志賀氏菌,必須侵入腸壁才能致病.因此,對粘膜組織的侵襲力是決定致病力的主要因素.
      內毒素:志賀氏菌屬中各菌株都有強烈的內毒素,作用于腸壁,使通透性增高,從而促進毒素的吸收.繼而作用于中樞神經系統及心血管系統,引起臨床上一系列毒血癥癥狀,如發熱、神志障礙,甚至中毒性休克.毒素破壞粘膜,形成炎癥、潰瘍,呈現典型的痢疾膿血便.毒素作用于腸壁植物神經,使腸道功能紊亂,腸蠕動共濟失調和痙攣,尤其直腸括約肌最明顯,因而發生腹痛、里急后重等癥狀.
      外毒素:志賀氏菌1型及部分2型(斯密茲痢疾桿菌)菌株能產生強烈的外毒素.為蛋白質,不耐熱,75-80攝氏度1小時即可破壞.其作用是使腸粘膜通透性增加,并導致血管內皮細胞損害.外毒素經甲醛或紫外線處理可脫毒成類毒素,能刺激機體產生相應的抗毒素.一般認為具有外毒素的志賀氏菌引起的痢疾比較嚴重.
       
      所致疾病:志賀氏菌引起的細菌性痢疾可分為兩類6型.
      急性細菌性痢疾:又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型.急性典型菌痢癥狀典型,有腹痛腹瀉、膿血粘便、里急后重、發熱等癥狀.各型菌都可引起,以志賀氏菌引起的較重,宋內氏菌引起的較輕.經治療,預后良好.如治療不徹底,可轉為慢性.急性非典型菌痢癥狀不典型,易診斷錯誤延誤治療,常導致帶菌或慢性發展.急性中毒性菌痢小兒多見,各型菌都可發生.中毒性菌痢一系列的病理生理變化,主要是內毒素造成機體微循環障礙的結果.導致內臟淤血、周圍循環衰竭(休克),主要功能器官灌注不足,發生心力衰竭、腦水腫,急性腎功能衰竭.嚴重微循環障礙,再加上內毒素損傷血管內皮細胞、激活凝血因子等,而發生彌漫性血管內凝血(DIC).
      慢性細菌性痢疾:又分慢性遷延型、慢性隱伏型、急性發作型三型.慢性遷延型,通常由急性菌痢治療不徹底等引起.病程超過2個月,時愈時發,大便培養陽性率低.在有臨床癥狀時為急性發作型,該型往往在半年內有急性菌痢病史.慢性隱伏型菌痢,是在一年內有過菌痢病史,臨床癥狀早已消失,但直腸鏡可發現病變或大便培養陽性.
       
      志賀氏菌帶菌者有三種類型.A.健康帶菌者,是指臨床上無腸道癥狀而又能排出痢疾桿菌者.這種帶菌者是主要傳染源,特別是飲食業、炊事員、和保育員中的帶菌者,潛在的危險性更大.B.恢復期帶菌者,是指臨床癥狀已治愈的病人,仍繼續排菌達2周之久者.C.慢性帶菌者,是指臨床癥狀已治愈,但長期排菌者.
       
      免疫性:病后有一定的免疫力,但免疫期短,也不穩定.可能因本菌屬菌型眾多,相互間無交叉免疫性之故.免疫性與血中抗體似乎無關,而與腸道粘膜細胞吞噬能力加強和機體對痢疾桿菌內毒素耐受性提高有關.腸道分泌型抗體即糞抗體亦有一定作用.糞抗體出現早、消失快,在膿血粘便中,糞抗體檢出率高達90%.這為志賀氏疫苗經口免疫的可能性,提供了理論依據.
       
      檢驗和控制:
       
      增菌培養:
      宋內氏志賀氏菌的增菌培養;以無菌的手續稱取樣品25g放入事先加有0.5μg/mL新生霉素的250mL志賀氏菌肉湯中,將此混懸液于室溫中靜置10min并時時振搖之.將浸液傾入滅菌的500mL錐形瓶中,調整pH,必要時用1NNaOH或1NHCL調至pH7.2±0.2,再將此錐形瓶置于加有新鮮催化劑的厭氧缸中,放入GasPak并加水使之活化.因此厭氧罐內部溫度較高,每次用后皆應將催化劑加熱.將厭氧罐置于44.0攝氏度水浴中培養20h,振搖混懸液后劃線接種于麥康凱氏瓊脂平板.于35攝氏度培養20h.
      對其他志賀氏菌的增菌培養亦按上述方法進行.但加入新生霉素量為3μg/mL,并在厭氧環境下置42.0攝氏度水浴培養.
       
      志賀氏菌的分離
       
      常規培養方法
      檢查麥康凱瓊脂平板,志賀氏菌的菌落為淺粉紅色,半透明,將此可疑菌落接種于下列培養基中:葡萄糖肉湯,TSI瓊脂斜面,賴氨酸脫羧酶肉湯,動力試驗瓊脂和胰胨.置35攝氏度培養48h,但應在20h進行檢查,棄去所有有動力、產H2S、產氣、賴氨酸脫羧以及發酵蔗糖與乳糖的培養物.關于產生吲哚者,應棄去其44攝氏度增菌物中的陽性培養物.至于42攝氏度增菌培養中的所有可疑培養物皆有可能是陽性或是陰性,因此皆應予保留.
      平板培養基的圖片
      生理學性狀
      將初篩反應良好的培養物再接種其他生化試驗,志賀氏菌的特性概述如下分離:H2S、尿素酶、葡萄糖、(產氣)運動、賴氨酸、脫羧酶、蔗糖、側金盞花醇、乳糖(2日)、KCN、丙二酸鹽、檸檬酸鹽、與水楊素皆為陰性;甲基紅為陽性.用抗血清鑒定其血清型或參照表二所列32個血清型的生物學特性進行試驗.其粘液酸鹽(mucate)和乙酸鹽(acetate)的反應是會有所幫助的.在這些反應中志賀氏菌一般為陰性,而不產氣的大腸桿菌一般至少在此反應中的一項為陽性.
       
      血清學性狀:
      將犢牛肉浸汁瓊脂斜面的24h培養物混懸于3mL0.85%生理鹽水中,使其濃度相當于標準比濁管第5號,在潔凈的玻璃平皿上用蠟筆標記9個3x1cm的方塊.按照以下方案滴加混懸液,抗血清與生理鹽水.
       
      方塊混懸液多價血清生理鹽水
       
      AA1BCC1C2DA-D
      1++
      2++
      ++
       
      用接種針攪勻每個方塊中的內容物,注意不要使方塊之間互相混亂.動搖平皿3-4min以促進其凝集作用.并按以下記取其凝集反應的程度:0=無凝集反應,1+=勉強可察覺的凝集反應,2+=呈50%清澈的凝集反應,3+=呈75%清澈的凝集反應,4+=有可見的絮片狀的凝集反應,混懸液完全清楚清澈透明.再以呈現明顯陽性(2+、3+、4+)的多價血清所屬的單價血清重新檢查其混懸液,如呈陰性反應,則將混懸液置蒸鍋中加熱30min以水解能起干擾作用的莢膜抗原.此時如與反應單價血清呈陽性,則再以多價血清檢查.由于這些系推測的血清型,故所有可能與所用血清呈陰性反應.
       
      預防控制志賀氏菌流行最好的措施是良好個人衛生和健康教育,水源和污水的衛生處理能防止水源性志賀氏菌的爆發.對可疑的食品,包括在食用前用手處理過或經輕微加熱的食品、動物源性食品或消費者直接入口的產品,且其酸度范圍在pH5.5-6.5之間.一般來說,當食品中含有大腸菌群、大腸桿菌和沙門氏菌時,含有志賀氏菌的可能性極大.
       
      菌痢的防治除對急性菌痢、慢性菌痢和各種帶菌者進行“三早”措施(早期診斷、早期隔離和早期治療)以消滅傳染源外,應采取以切斷傳染途徑為主的綜合性措施.開展愛國衛生運動,抓好食品加工飲食服務行業的管理,對從事食品加工人員應定期作帶菌者檢查.
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