<th id="hta7t"><sup id="hta7t"></sup></th>

<th id="hta7t"><sup id="hta7t"></sup></th>

    <th id="hta7t"><video id="hta7t"></video></th>
  1. <th id="hta7t"><option id="hta7t"></option></th><object id="hta7t"></object>
    1. <code id="hta7t"></code>
    2. <output id="hta7t"></output>

      <code id="hta7t"><em id="hta7t"></em></code>

      實驗室常用試劑配制顯色液

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:

      一次性的預灌裝培養基


      實驗室常用試劑配制 顯色液
       
      免疫細胞化學中,由于抗原-抗體反應所形成的復合物本身無色,無法直接觀察,因而需借助于某些化學基團的呈色作用,使其得以顯示,以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有:
      DAB 即3,3-二氨基苯聯胺
      試劑:DAB(常用四鹽酸鹽) 50mg
      0.05mol/L TB 100ml
      30% H2O2 30~40μl
      配制方法:先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB 溶解DAB,然后加入余量TB,充分搖勻,使DAB 終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%的H2O230~40μl,使其終濃度為 0.01%。
      DAB 顯色液主要用于免疫過氧化物酶法(如酶標法、PAP 法等),其終產物可直接在光鏡下觀察,也可經OsO4 處理后,增加反應產物的電子密度,用于電鏡觀察。但有幾點需注意:DAB 溶解要完全,否則未溶解的顆粒沉積于標本上影響觀察;DAB 濃度不易過高,否則顯色液呈棕色,增加背景染色,另外DAB 有致癌作用,故操作時應戴手套,盡量避免與皮膚接觸,用后及時徹底沖洗,接觸DAB 的實驗用品最好經洗液浸泡24h 后使用。
       
      實驗室常用試劑配制 顯色液
       
      配方 1:4-Cl-1-萘酚 100mg
      純乙醇 10ml
      0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml
      30% H2O2 10μl(0.003%)
      配制方法:先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中,然后加入Tb 19ml,用前加入30% H2O2 使其終濃度為0.005%,切片顯色時間通常為5~20min。
      配方2:4-Cl-1-萘酚
      N-二甲基甲酰胺(DMF)
      0.05mol/L TB(pH7.6)
      30% H2O2
      配制方法:先將4-Cl-1-萘酚加入DMF 中,加熱溶解使呈乳白色,再加入TB,乳白色變為絮狀,在7.5℃加熱 5min 后加入H2O2,攪動使絮狀消失,趁熱過濾,當降至略低于50℃時才放入組織標本(注意:溫度過高易損傷標本,過低則易重新出現沉淀)。顯色時間通常為5min 左右。
      4-Cl-1-萘酚的終產物顯示藍色。
      多數認為最好去除白色沉淀(如上述),但Larsson  等認為,白色沉淀可作為背景,使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標本,勿用酒精脫水。
       
      試劑:AEC   20mg
      二甲基甲酰胺(DMF)   2.5ml
      0.05mol/L 醋酸緩沖液(pH5.5)   50ml
      30%H2O2   25ml
      配制方法:先將AEC 溶于DMF 中,再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前,加入30%H2O2。切片顯色時間為5~20min。
      該顯色液作用后,陽性部分呈深紅色,加以蘇木精或亮綠等作為背景染色, 則效果更佳。由于終產物溶于酒精和水,故需用甘油封固。
       
      試劑:TMB
      HCl
      亞硝基鐵氰化鉀
      無水酒精
      配制方法:
      (1)醋酸鹽緩沖液:取1.0mol/L 的HCl 190ml 加入1.0mol/L 的醋酸鈉400ml中混合,再加蒸餾水稀釋至1000ml,用醋酸或NaOH 將pH 調至3.3。
      (2)A 液:取上述緩沖液5ml,溶解100mg 亞硝基鐵氰化鉀,加蒸餾水92.5ml混合。
      (3)B 液:稱取5mg TMB 加入2.5ml 無水酒精中,可加熱至37℃~40℃ 直到TMB 完全溶解。
      (4)孵育液:放入標本前數秒,取2.5ml B 液及97.5ml A 溶于試管中充分混合。(液體在20min 內應保持清亮的黃綠色,否則可能已有污染)。酶反應時, 加入終濃度為 0.005%的H2O2。
      (5)主要顯色步驟:組織標本在蒸餾水(或PBS)中漂洗數次(每次約10~15min)后放入未加H2O2 的孵育液中作用20min(19℃~30℃),然后向孵育液中放入H2O2(每100ml 孵育液中加0.3%的H2O2 1.0~5.0ml)繼續孵育液20min 左右(19℃~23℃),撈出標本漂洗數次(共30min 左右)。在0~4℃條件下可在漂洗液放置 4h 直至貼片、脫水,封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負染2~3min,也可在1%派諾寧(pH3.3~3.5)中負染5min 后貼片、脫水、封片。
      TMB 即四甲基聯苯胺(Tetrabenzidine)是一種脂溶性較強的基團,因此容易進入細胞與細胞器中的HRP 反應,且由于這種高度的脂溶性,使其易形成多聚體,在HRP 活性部位產生粗大的、深蘭色沉淀物,這使得TMB 成為組化實驗中的一種很好的發色團。同時反應產物的沉淀,使得HRP 的活性部位更加暴露,利于酶氧化反應進行。
      TMB 的反應產物為深藍色,利于光鏡觀察,且反應產物越聚越大,常超出單個細胞器的范圍(而DAB 則被限制在其內),故TMB反應的檢測閾較低。由于上述優點,目前TMB  常用于光鏡及超微結構水平的HRP及HRP-WGA 神經投射的研究。需要注意的是:TMB 顯色液中的A 液和B 液應在2h 內新鮮配制。另外,TMB 是一種較強的皮膚刺激劑,并有致癌的潛在可能,故使用時應帶手套及在通風條件下操作。
       
      試劑A 液:5%NBT:稱 取 0.5gNBT 溶于10ml 70%的DMF(二甲基甲胺) 內,充分混合,常存于 4℃,也可裝成小份,-20℃保存,用前復溫。
      B 液:5% BCIP:稱取BCIp 0.5g 溶于10ml 100%的DMF 內,混勻。4℃或分裝存于-20℃,用前恢復至室溫。
      C.顯色液:取A 液40μl,加入到盛有10ml 的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管內,充分混勻;再加入B 液40μl,輕輕混合即可。最好用前新鮮配制。
      NBT 即四唑氮藍(Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818,為深藍色無定形微溶物質。BCIP 即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。當二者存在時,在堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)作用下,NBT 被還原形成顯微鏡下可見的藍色或紫色沉淀。
       
      qdrishui.cn
      一本色道久久综合亚洲精品,综合久久给合久久狠狠狠97色,一本色道久久综合一区,亚洲精品人成无码中文毛片
      <th id="hta7t"><sup id="hta7t"></sup></th>

      <th id="hta7t"><sup id="hta7t"></sup></th>

        <th id="hta7t"><video id="hta7t"></video></th>
      1. <th id="hta7t"><option id="hta7t"></option></th><object id="hta7t"></object>
        1. <code id="hta7t"></code>
        2. <output id="hta7t"></output>

          <code id="hta7t"><em id="hta7t"></em></code>