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      微生物檢測實驗室:標準菌株的管理

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


      1.1標準菌株概念
      GB/T 27405-2008 實驗室質量控制規范食品微生物檢測:
      1、標準培養物:標準菌株、標準儲備菌株和工作菌株的統稱。
      2、標準菌株:至少定義至屬或種水平的菌株。按其特征進行分類和描述,有明確的來源。
      3、標準儲備菌株:標準菌株經過一代轉接后獲得的同種菌株。
      4、工作菌株:由標準儲備轉接后獲得的同種菌株。
      1.2標準菌株的應用:
      各種國際標準、國家標準、行業標準及企業標準等的相關微生物檢測,用于驗收培養基(包括試劑盒)、驗證方法和評估實驗操作。
       
      微生物菌種管理的相關流程
       
      2.1菌株的采集:
      實驗室用菌種一是到國家法定機構采購,二是購買ATCC菌種,三是科研中菌種交流。不管是哪種來源,均統一采集。采集中嚴格按照規范執行。要求包裝可靠,采集迅速,不泄漏不污染。保證菌種合格和環境安全。采集中要有菌種傳代標識。選擇有資質的標準菌株的合格供應商,每批標準菌株必須附帶有供應商的合格證或檢測報告或說明書,來證明所采購的標準菌株是合格的。
       
      2.2標準菌株和驗收:
      實驗室收到標準菌株,首先應進行符合性感官檢查,記錄菌株號和標準菌株來源途徑信息,確保溯源性清楚。同時還應記錄標準菌株名稱和數量、生產日期、接收日期和有無破損等情況。
       
      2.3凍干標準菌株的復活:
      2..3.1開啟產品包裝:先用70%酒精棉擦拭外包裝,從凹口處撕開產品外包裝,撕掉標簽上的拉片,將其貼于菌株接收、保存記錄序號前面。
       
      2.3.2復活:選擇合適的培養基和培養條件(根據生產商說明或有關技術通則見附錄)進行復活。菌種的首次活化最好是在非選擇性瓊脂培養基上,除非特殊情況或特別推薦,一般不用液體培養基。凍干菌株的傳代次數不得超過5代,從標準菌株保藏中心購買的凍干標準菌株為第F0代。捏管帽處安瓿瓶(僅一次)使其釋放水合液體。垂直握住安瓿瓶并輕拍之,使液體流入含小球的管底。通過擠捏壓碎小球使其與液體混合,立即將拭子浸于水合液體。擠壓并旋轉拭子,接種于初級培養平板,接種圈的直徑約為25mm,用一無菌接種環在先前接種區域劃線10-20次,促使分離出單菌落。同時吸出部分菌液接種胰蛋白胨大豆肉湯管,副溶血性弧菌接種3%氯化鈉菌胰蛋白胨大豆肉湯管。將接種好的平板和管立即進行培養。細菌培養溫度通常為25℃或37℃。多數凍干菌株會在幾天后長出,但是少數菌會表現出延滯期延長的現象,需要將正常培養時間加倍。復活后的菌株為F1代。
      2.3.3:將TSB生長的濃菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混勻后將液體吸出,將保藏管-18℃保存1-3年為標準儲備菌株F2代。將平板上生長的良好菌株接種于營養瓊脂斜面(副溶血性弧菌用3%氯化鈉營養瓊脂)36℃培養24h當作工作菌株,記錄為F3代。
      株為F1代
      2.4工作菌株確認方法及依據:
      用無菌接種環取上述培養物,在相應的培養基平板(營養瓊脂、大豆胰蛋白胨瓊脂)上或相應的細菌鑒別平板(如伊紅美藍、麥康凱、BP等上劃線分離單個菌落,置適宜條件下培養(若該類微生物為厭氧菌,則培養條件應為厭氧條件)以同樣方法取真菌和酵母菌至SDA(薩布羅培養基)平板上或玫瑰紅鈉培養基平板上,23~28℃下培養7d;培養后觀察是否具有典型的菌落狀態,然后挑取單一純菌落,進行革蘭染色、鏡檢,觀察其染色特征及菌體形態以確定菌種。
       
      2.5 污染處理:
      假如在該平板上發現有其他菌落生長,則說明操作有污染或菌種不純。要將該污染培養物做滅菌處理,尋找原因,重新分離挑選純菌落。
       
      2.6菌種保存:
      所有菌種均由實驗室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺帳,詳細記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況;每一種菌種一定要有檢測鑒定報告(具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法);具體菌種保存方法一般為:
      將復蘇后肉湯與滅菌甘油按15%甘油比例(肉湯8.5mL+甘油1.5mL)混合,-30 ℃凍存,(可用2mL凍存管凍存多管),作為保藏儲備菌株F1代,也可使用商品化的菌種保存管。
      微生物菌種保存管圖
      2.7菌種的傳代
      2.7.1標準菌株的復蘇:
      ① 菌種操作應在無菌條件下進行,防止雜菌污染。
      ② 每次使用和復蘇時只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養。
       
      2.7.2標準儲備菌株每轉接一次須進行確認。(確認方法一般為他們各自獨有的形態,在鑒別培養基上的形態)
       
      2.7.3工作菌株轉接的方法:
      ①配制營養瓊脂培養基(溶血性弧菌加3%氯化鈉 ),121℃高壓滅菌15分鐘后分裝在試管內,冷卻后備用。
      ②在無菌條件下,用接種環挑取菌苔至新鮮試管上作“米”字形劃線接種,放置在36℃的培養箱內培養24小時。
       
      2.7.4工作菌株的使用:
      2.7.4.1內部質量控制:一個月一次陽性對照、培養基每批驗收;
      2.7.4.2外部質量控制:能力驗證、實驗室比對;
       
      2.7.5工作菌株的期間核查:
      2.7.5.1期間核查的頻率:每半年對使用標準菌株進行一次期間核查。
      2.7.5.2工作菌株期間核查的方法及依據:同工作菌株的確認一樣。
      2.7.5.3建立標準菌株期間核查記錄。
       
      2.8菌種的標識和使用期限:
      2.8.1標識:菌種代數的計算為干粉菌種為第0代,轉接一次加一代。
      具體標識為:例單增李斯特氏菌第0代,標識為DZ-0,第一代標識為DZ-01第一代有12支,則DZ-01-01、……、DZ-01-12;并標明日期:如2017.02.13這樣填寫。
       
      2.9 菌種的保藏:
      2.9.1將試管內菌種放入冰箱中2~8℃冷藏保存。
      2.9.2將傳代并經過培養后的菌種放入冰箱中2~8℃保存。
      每支保存菌種需標明菌名、標準編號、傳次、傳代日期。
       
      2.10菌種的銷毀:
      2.10.1菌種使用后或超過貯存期的應進行銷毀。
      2.10.2需銷毀的菌種,應用高壓蒸汽(121℃)滅菌30分鐘。
      2.10.3滅菌后,再進行清洗和處理。
       2.10.4銷毀的菌種應做好記錄。銷毀時由化驗負責人監督銷毀,保管人員負責銷毀。
       
      實驗室常用菌株保存方法
       
      1.斜面低溫保存法
      將分純的待存菌接種于適宜的固體斜面培養基上,得到充分生長后,用封口膜封口,貼上標簽,保存于4℃的冰箱中。此法操作簡單、使用方便、不需要特殊設備,是實驗室菌種保存最常用的方法。但保存時間短,一般每個月都要移
      種1次,而且菌種容易變異,所以此方法只適合實驗室短期實驗菌株的保存。
       
      2.半固體瓊脂法 
      用接種針將以分純的待存菌,穿刺接種于半固體中,放入培養箱培養后出,封上無菌的液體石蠟,貼上標簽,放4℃冰箱保存。此方法簡便易操作,不需特殊設備、技術難度不大,但保存的時間不長,一般只能保存1年以內,而且對抵抗力弱以及一些特殊菌種大概只能存活3~6個月,需要頻繁的傳代,這樣很容易使菌株受到污染、變異。所以此方法不適用菌種的長期保存,只適合實驗室一些要求不高的菌種的短期保存。
       
      3.液體石蠟保存法 
      將液體石蠟滅菌,放于37℃恒溫箱中,使水汽蒸發掉備用。再將已分純的待存菌在最適宜的斜面培養基中培養,使得到健壯的菌體,用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟,注入已長好的斜面培養基上,用量以高出斜面1cm為準,將試管直立,
      貼上標簽,置4℃下保存。此法制作簡單,不需要特殊設備,菌種可以保存1年左右不需要經常移種,缺點是保存的時候需要直立放置。此方法適合實驗室短期保存,而且保存時需要一定的空間。
       
      4.高層半固體瓊脂石蠟保存法
      將待存菌經平板劃線分離后,挑單個菌落用接種針反復穿刺接種到高固體瓊脂培養基中,經培養箱培養后取出,用滅菌過的液體石蠟滴加到半固體瓊菌種管表層約0.5cm高度,貼上標簽,存放4℃冰箱。此法操作簡便,不需要特殊設備,效果好,可以保存菌株1~2年。所以適合實驗室菌株的較長期的保存。
       
      5.紙片法 
      將已分純的待存菌用無菌鑷子鑷取紙片,在紙片上刮取4~5個菌落,入凍存管內,蓋上蓋子后用封口膠布封住邊緣,貼上標簽,放入冰箱冷凍保存(-20℃左右)。此方法具有操作簡單、不需特殊設備、經濟實用、保存空間小等而且保存時間至少2年,但對一些營養要求比較高的菌種,存活率不理想。所以方法適合實驗室一些營養要求不高的菌種較長時間的保存。
       
      6.甘油液保存法
      將已分純的待存菌接種于肉湯中,37℃培養18~24h,然后按5份肉湯溶液、2份甘油-生理鹽水保存液的比例分裝于滅菌的微量離心管或細胞凍存管中,貼上標簽,置-80℃~-20℃冰箱保存。此法操作簡便,不需要特殊設備,效果好,可以保存菌種3年左右,無變異現象,而且此方法還可以保存一些要求較高的特殊菌種,適用范圍廣。所以此方法適合實驗室普通菌種或特殊菌種的較長期的保存。
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