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      分枝桿菌在液體培養基中的L型誘導

      發布時間:

      2022-12-27

      作者:


      摘要:通過對不同生長時期的卡介苗及恥垢分枝桿菌以不同組舍和濃度的D一環絲氨酸(cyc)和氨芐青霉素(腳)進行L型誘導,綜舍染色鏡檢,菌落形態觀察及計數,以及對十二烷基磺酸鈉(sDs)敏感性測定的結果,發現在對數生長晚期開始誘導,cyc和AMP的濃度分另lI為1.0mg/ml~0.1m時誘導效果最好,誘導率可達80%左右。
       
      分枝桿菌是人類的一類重要致病菌,雖然結核病在全世界范圍已經得到控制,但是在一些發展中國象仍有流行。據統計,全世界仍有約1600萬病人,每年的新發和死亡病例數分別達800萬和300萬。近年來一些非典型分枝桿菌經常出現在機會感染中,在國外也是艾滋病常見伴發感染的一類重要病原菌。然而,相對于其它原核生物,人類對分枝桿菌分子永平的研究還相當落后,因麗近些年國外許多實驗室都加強了這方面的研究,如染色體基因克隆,質粒分布狀態,基因重組等“,而這些實驗的基礎就是核酸的提取。由于分枝桿菌胞壁結構中粘酞層不僅含量少,而且其外面有一層由脂蛋白和脂多糖組成的脂質保護層,因而常規的方法如溶菌酶無法去除其胞壁,需預先利用一些誘導劑使其脫去胞壁,再裂解提取其核酸。誘導的方法從60年代就有報道,但因為誘導率不高,直至80年代,人們仍在尋找理想的方法。正是有鑒于此,本文試圖通過兩種最常用的誘導劑環絲氨酸和氨芐青霉索,以不同濃度和組合對不同生長時期的兩株遲緩生長和快速生長型分枝桿菌進行誘導,以探索獲得最佳效果的途徑。
       
      材料與方法
       
      菌株
      1·卡介苗本校微生物教研室保存之丹麥株菌種。
      2.恥垢分枝桿菌購自衛生部北京藥品生物制品檢定所。
      誘導試劑
      環絲氨酸購自美國Sigma公司,氨芐青霉索購自西德B0ehringeZ公司。將粉劑以雙蒸水分別配成50mg/ml,25mg/ml,過濾腺菌后分裝貯于一20℃。
      培養基
      1.固體培養基采用米氏7H10固體瓊脂培養基配法是將基礎物質溶于蒸餾東中,分裝成每瓶90ml,高壓滅菌后備用。用時再融化,每瓶加入油酸牛清蛋白葡萄糖混合液10ml,過氧化氫酶溶液0.3ml。
      2.液體培養基采用米氏7H9液體培養基,內含Tween-800.05%。
      培養及誘導
      1.培養取保存于米氏7H10平板上的新鮮卡介苗和恥垢分枝桿菌,分別接種于50ml氏7H9液體培養基,37℃以130轉/分振蕩培養。卡介苗在10天后以3比例轉種大量米氏7Hg液體培養基,以同樣條件繼續培養。恥垢分枝桿菌則在6小時后以1比例轉種,也以同樣條件繼續培養。
      2.誘導卡介苗從0De。。=0.1開始,每隔4天取樣,分作5瓶,分別加入下列列各組誘導劑,誘導時間為72小時。恥詬菌則從0D。0=0.3開始,問隔3小時取樣,分作5瓶加入各組誘導劑,誘導時間為16小時。
      3.請導劑分組單位均為mg/mlA.cyc1.0。B.AMP0.1.C.cyc0.5÷AMP0.05.D.cyc1.0}AMP0.1.E.cycI.5+AMP0.15。
      結果觀察
      1.抗酸染色按常規方法進行。陽性者呈紫紅色,陰性者呈蘭紫色。
      2.胞壁米色參照文獻””介紹方法進行。有胞壁的細菌外周著色深,中央著色淺;無胞壁的細菌則通體顏色深淺一致。但對于長
      桿形細菌,較難區分。
      3.茵落彤態觀察及計數。取0.Iml未加誘導劑和誘導之后的紐苗培養物作1:100稀釋后,取501~I涂于米氏7H10平板上。生長良好后觀察蔭落形態并計數。
      4.對SDS敏感性試驗取培養物]0ml~.I6000轉/分離心10分鐘收集,沉淀懸于0.3ml緩沖液(40mm0l/LTris—HCI.pH8.0;0.15ret00l/LEDTA),加A.20SDS至終濃度為3%.放60℃10分鐘。如果誘導效果好,則懸液逐漸變清,否則始終為混濁液。進一步觀察可于室溫冷卻后,離心沉淀,去大部分上清,取沉淀懸液作抗酸染色后鏡檢。
       
      結果:不同生長周期細菌對誘導劑的敏感性。
       
      與細菌培養的不同時期加入誘導劑,結果發現如果誘導劑加入過早,細菌剛開始大量繁殖就被抑制,細菌數量太少,達不到增菌的H的;但加入太遲,細菌分裂很少,對誘導劑不敏感,誘導效果不佳不論卡介苗還是恥垢分枝桿菌,均在對數生長晚期,(卡介苗0D為0.25~0.30,恥垢菌0D日0。在1.0~1.4之間),細菌已經大量繁殖,且仍在活躍分裂時,加入誘導劑效果最好。在靜止期和對數生長晚期加入誘導劑誘導毒后經胞壁染色可見靜止期誘呼的斂果欠佳,太部分細菌還保留有完整的胞壁;麗對數生長晚期開始誘導則效果較好,大部分細菌已不見胞壁結構。
       
      不商組臺和濃度誘導劑的誘導效果,通過比較5組誘導劑的效果,發現以環絲氨酸配臺氨芐青霉素,且它們的濃度分別為1.0mg,ml和0.Img/ml為最好,誘導率可達80%。如果再增加濃度則使細菌死亡裂解過多,培養液0D值下降很大。
       
      計論:我們分別選取卡介苗和恥垢分枝桿菌作為遲緩生長和快速生長型分枝桿菌的代表,經液體培養描出其生長曲線后,于不同的生長時期加入誘導劑進行誘導,結果發現二者均在對數生長晚期開始誘導效果最好。這可能是因為我們所田兩種誘導荊都懸通過于擾施壁合成而達到誘導目的。
      細胞壁合成可分為3個階段”,第一階段即含有五肽的N。一乙酰胞壁酸和N一乙酰葡糖胺的臺成。環絲氨酸具有與五肽最后兩個氨基酸兩氨酸結構相似的特點,通過競爭抑制了D_丙氮酰—D一丙氨酸的臺成。氨芐青霉素則作用于第3個階段其原理一般認為是因為其與五肽末端的D-丙氨酰一Dh丙氨酸結構部分相似,能與交聯反應所需的轉肽酶結合而使其失活。因此,這兩種誘導劑都是作用于胞壁合成,只不過具體環節不同,所以對靜止期細菌效果差而對仍在活躍分裂繁殖的細菌效果好。
       
      另外,參照國外文獻的報道,我們從低濃度開始擬定了5種不同組合和濃度的誘導劑,綜合染色鏡檢,菌落形態觀察及計數,以及對SDS敏感性實驗結果,發現以1.0mg/m】cyc+0.1mg/mlAMP組和1.5mg/mlcyc+0.15rag/mlAMP組效果最好,可達80%以上,明顯地優于單用環絲氨酸或單用氨芐青霉素。其原理可能在于這兩種誘導劑通過作用于胞壁臺成的不同環節麗起協同作用,使胞壁臺成抑制更徹底。誘導后培養液0D值出現下降,下降幅度在0.01~0.25之間,與誘導劑濃度呈正相關。這可能是因為L型菌的誘導不是一個單純脫去胞壁的問題,還牽涉到一系列細胞分裂機制,并非每個細菌都可以誘變成L型菌。如果誘導劑濃度過高,會干擾細胞分裂過程如間體的形成,使不能分裂繁殖的細菌增多,這些細菌逐漸老化,死亡裂解。考慮到這一因素,我們認為以1.0mg/mlcyc+0.1mg/mlAMP組較為適宜。我們的這一結果與國外報道的基本一致。
       
       
      曾益新  彭文偉
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